4.接種培養(yǎng)。在無菌條件下取母種菌絲，并用接種鉤將菌絲接入試管培養(yǎng)基中部，置于培養(yǎng)箱中25℃黑暗培養(yǎng)。

（二）抽濾瓶液體菌種生產(chǎn)

1.生產(chǎn)配方。豆粕粉4g，玉米粉3g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，凈化水1000ml。

2.培養(yǎng)基制備。稱量上面所有原料，要求每瓶分別稱量，主要防止各瓶營養(yǎng)物質(zhì)不均衡。每瓶2500mL抽濾瓶，將上面原料全部加入，滴一滴消泡劑，一個攪拌子，一片VB1。塞上硅膠塞，用一次性口罩2個交叉蓋嚴硅膠塞及瓶口，用橡皮筋扎緊，因臥式******器******后會在高壓條件下自動排汽，防止硅膠塞跳出，需要用細鐵絲擰緊瓶口。

3.******。將抽濾瓶豎直放入******器，121℃******45分鐘，******器排汽降溫后，******室壓力歸零及時將抽濾瓶取出，因******時間多加了15分鐘，悶鍋時間過長會損失過多營養(yǎng)物質(zhì)。放置室溫無菌環(huán)境下冷卻至28℃，再放入超凈工作臺內(nèi)。

4.接種。將抽濾瓶、酒精燈、接種鉤、兩把鑷子、75%酒精棉、75%小酒精噴壺、生產(chǎn)用母種放入超凈，母種遠離紫外線燈一側(cè)，蓋上一次性口罩，開啟紫外線燈消毒20分鐘。然后開啟風機，關(guān)掉紫外線燈，打開照明燈，戴上一次性橡膠手套，酒精消毒手及手臂、工作臺接接鉤、抽濾瓶。點燃酒精燈，灼燒接種鉤放至一側(cè)鑷子上備用，將抽濾瓶去掉一次性口罩，用火焰圍繞瓶囗灼燒******(可拿酒精燈或使用提前鑷子夾少許酒精棉點燃灼燒)，用接種鉤將母種在火焰保護下按壓擠碎，取小指甲蓋大小一撮菌種，一手拿接種鉤，一手打開抽濾瓶瓶塞，放入菌種后迅速塞上瓶塞，蓋上一次性口罩。

5.培養(yǎng)。抽濾瓶放入全溫搖床上25℃，150r/mⅰn，培養(yǎng)4天，將有豆粒大小菌球出現(xiàn)，放到磁力攪拌器上打碎菌球，以增加萌發(fā)點。24小時后再放至全溫搖床內(nèi)培養(yǎng)兩天，然后取出放至磁力攪拌器上，控制好攪拌子轉(zhuǎn)速，******液濺到瓶身上部。此時要確定菌球大小基本都在黃豆粒大以下為好，菌球總量占總體積4/5為宜。

（三）發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)

1.發(fā)酵罐清洗。要求罐體內(nèi)外各個角落都清洗干凈，不允許有一點污漬，要上開蓋，下開閘，保持罐體干燥備用，不進行空消。

2.發(fā)酵料配方。按每升豆粕粉8g，玉米粉5g，豆粉3g，紅糖15g，葡萄糖5g，磷酸二氫鉀0.2g，硫酸鎂0.1g。

3.預加水升溫。加水至夾層焊線位置，提前開啟蒸汽發(fā)生器，0.6MP壓力備用，將蒸汽管路中的冷凝水先排入下水管，然后再打開波紋管連接蒸汽管路的閥門，開啟發(fā)酵罐下面進蒸汽閥門進蒸汽******，當蒸汽遇冷水會產(chǎn)生"振爆"，可適當開啟氣源閥門通入空氣減小"振爆"現(xiàn)象，即減小噪音，又防止設備損壞，同時在通氣條件下還能攪拌發(fā)酵罐內(nèi)的水，可以不用達到50℃再添料，有效防止料粘罐底情況。

?4.投料定容。將培養(yǎng)料加水攪拌均勻，倒入發(fā)酵罐內(nèi)，添加消泡劑致培養(yǎng)液上面氣泡90%以上消失(約250ml)，補水至上觀察口下沿處，擦凈罐囗內(nèi)外，蓋好發(fā)酵罐蓋，對角均勻旋緊螺絲。

5.******。發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液升至95℃前，需要提前安裝上降溫、排水波紋管，同時確定好夾層加熱棒斷電，夾層無水。95℃以上"振爆″不明顯后關(guān)掉進氣氣源閥門，當溫度升至121℃計時，溫度不要超過125℃，保持溫度121℃-125℃90分鐘。

6.冷卻。******時間結(jié)束后，先關(guān)掉罐底閥門，再關(guān)蒸汽管路上閥門，再關(guān)蒸汽發(fā)生器，不可反向操作，防培養(yǎng)液倒流污染。開啟氣源閥門通氣，當氣壓超過0.15Mp時，打開夾層進冷水閥門，夾層上囗排水閥門要常開的，或者不安裝，接種口閥門關(guān)掉，排氣閥門要常開，防止誤關(guān)造成設備損壞。接通加熱棒電源，設置到24℃啟動，26℃停止。

7.接種工具準備。首先，關(guān)閥空調(diào)、正壓風機等造成接種室內(nèi)空氣流動加速的設備，室內(nèi)酒精消毒，如果有紫外線燈開啟20分鐘。隨后關(guān)紫外線燈，接種要戴一次性橡膠手套，準備抽濾瓶菌種、火焰架、95%酒精棉、兩個接種用梯子、半桶干凈的水、75%酒精棉及噴壺、滅火用小鋼盆或濕毛巾、火機。

8.接種。用75%酒精棉擦拭接種囗圍邊及接種囗，安裝火焰架，點燃酒精棉在火焰保護下把抽濾瓶接管與接種口對接，將排氣囗排氣管前端單向閥取下，把排氣管放入水桶中，關(guān)掉氣源進氣閥門。當罐內(nèi)壓力歸零后，打開接種口閥門，將抽濾瓶菌種通過接種管送入發(fā)酵罐，抽濾瓶內(nèi)留少量菌種做鏡檢、平皿劃線檢測用。

9.培養(yǎng)。開啟氣源閥門，當氣壓升至0.01MP時關(guān)閉接種口閥門，拔掉接種管，用酒精噴壺清理接種口，安裝上排氣管前端單向閥，調(diào)整罐內(nèi)壓力0.05-0.1MP培養(yǎng)。貼好品種、接種時間標簽。24-26℃培養(yǎng)7-10天即可使用。

10.菌種檢測。液體菌種可接菌包數(shù)量大，需謹慎多次進行質(zhì)量檢測。

（1）日常檢測：每天要檢查發(fā)酵罐排出的氣味、菌球、菌絲形態(tài)及濃度變化、設備工作情況等，確保正常培養(yǎng)過程，4天后可取樣檢測。

（2）發(fā)酵罐菌種取樣檢測：火焰保護下在取樣口取******后的空瓶，裝約300m l液體菌種。將檢測培養(yǎng)基2瓶，PDA培養(yǎng)基平皿2個；******后待接菌料袋2袋及待測液體菌種放入超凈工作臺，紫外線******20分鐘，將液體菌約5~10m|倒入檢測培養(yǎng)基中置于37℃避光條件下培養(yǎng)24-48小時觀察是否有細菌菌膜，用接種鏟粘液體菌種在PDA培養(yǎng)基平皿上劃四條線置于28℃避光條件下培養(yǎng)12-24小時觀察菌絲是否萌發(fā)，裝液體菌種20ml均勻倒入料袋中置于28℃避光條件下培養(yǎng)12-24小時觀察菌絲是否萌發(fā)。

（3）顯微鏡檢測：用接種鉤另一端直鐵絲處粘一滴液體菌種滴到載玻片上，蓋上蓋玻片制成標本，800倍下觀察菌絲有無鎖狀聯(lián)合，有鎖狀聯(lián)合可正常使用。

11.液體菌種質(zhì)量標準。 大球蓋菇液體菌種整個培養(yǎng)過程中果香味，無異味；菌球均勻無破裂，菌球占比80%以上；取樣檢測無污染，菌球萌發(fā)時間短，菌絲粗壯 ；鏡檢鎖狀聯(lián)合明顯。

（四）液體菌種貯藏

1.母種。日常生產(chǎn)時，將母種置于冰箱4℃貯藏即可，如貯藏時間不超過3個月，使用時可取出后活化1-2天直接用于生產(chǎn)使用。

2.抽濾瓶液體菌種。可臨時置于冰箱4℃貯藏，為保障菌球活性，貯藏時間不超過15天為宜。

3.發(fā)酵罐液體菌種。培養(yǎng)7-10天后，如無法及時生產(chǎn)使用，可將培養(yǎng)溫度調(diào)低至20℃，同時減少發(fā)酵罐通氣量，以減緩菌絲生長速度。但整個培養(yǎng)周期不宜超過20天。（作者：山東莒縣政務服務中心趙君法，莒縣農(nóng)業(yè)技術(shù)服務中心門慶永 武辰陽李愛科 姚紅燕）